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纳米金刚石作为自噬抑制剂,可以提高三氧化二砷在实体瘤中的疗效

关键词 纳米金刚石 , 自噬抑制剂 , 肿瘤 , 砒霜|2019-11-25 09:38:01|技术信息|来源 英文文献悦读
摘要 说起三氧化二砷(Arsenictrioxide,ATO)大家都不陌生,它是砒霜中的主要成分,早在李时珍所著的《本草纲目》中便有记载:砒霜主治中风痰壅,疟疾以及项上瘰疬。砒霜不仅仅在...

说起三氧化二砷(Arsenic trioxide, ATO)大家都不陌生,它是砒霜中的主要成分,早在李时珍所著的《本草纲目》中便有记载:砒霜主治中风痰壅,疟疾以及项上瘰疬。

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砒霜不仅仅在中国古代有使用,在近代西方国家中也有使用。比较有名的记载是十八世纪二十年代英国人托马斯·弗勒发明的弗勒溶液,其后来也被收入到英国药典和美国药典中。

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但是砷具有强烈的毒性,1903年英国制造啤酒过程中由于原料砷污染,导致6000人中毒70人死亡,1928年法国有4万人由于面包和酒砷污染而中毒,1955年日本森永奶粉公司的配方生产过程中砷污染导致12131名新生儿中毒,130人死亡,等等。这一系列砷中毒事件使得砷剂的研究一度陷入低潮,直到2001年陈竺教授发表的文章——Arsenic trioxide, a therapeutic agent for APL. 才将砒霜从谷底捞出。

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然而,三氧化二砷ATO治疗白血病的疗效在实体瘤中却不能复制,经研究发现主要原因是实体瘤细胞自噬水平较高,其与凋亡形成拮抗,阻碍实体瘤进入程序性死亡。那么是否可以通过抑制实体瘤自噬,使得ATO促凋亡作中占主导,最终使天平向凋亡倾斜?

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2018年10月9日发表在Nature Communications上,IF:11.978,通讯作者:樊春海,单位:上海交通大学化学化工学院

1.纳米金刚石是一种十分强效的自噬抑制剂

多种纳米粒子表现出不同的细胞自噬抑制作用,为了找到一个安全有效的纳米粒子抑制剂,作者选用HepG2细胞检测了纳米金(AuNPs)、纳米三氧化二铁和四氧化三铁、纳米金刚石(NDs)等各种纳米粒子的自噬抑制作用。结果发现NDs、AuNPs和纳米四氧化三铁增加LC3-Ⅱ的积累,以及自噬底物p62(图1a)。为了进一步评估这些纳米粒子的自噬抑制作用,作者用shRNA靶向作用于ATG5,ATG7。ATG5/7缺失减少了NP诱导的LC3转化。免疫荧光结果也显示传统自噬抑制剂——氯喹CQ处理后导致黄色标记的LC3斑点增多。而NDs组红色标记的LC3斑点(mCherry阳性,GFP荧光阴性的自溶酶体)增加,这表明干扰了溶酶体清除(图1b)。因此,NDs与CQ有着不同的自噬抑制机制。CQ+NDs与NDs相比,LC3-Ⅱ增加,并且p62积累也增加,这进一步证实了NDs起到自噬抑制作用,以调节自噬通量和自体溶酶体通量(图1c)。综上,证实了NDs在细胞中的自噬抑制作用。并且进一步揭示NDs与CQ有着不同的自噬抑制机制,二者联合应用可以提高自噬抑制作用。作者接下来探索NPS是否能够影响ATO介导的HepG2凋亡。NDs和AuNPS增加了ATO介导的细胞凋亡,另外,ATG5/7缺失减少了NDs介导的ATO诱导的细胞凋亡(图1d)。在确定了NDs的自噬抑制作用后,作者进一步探究其在自体吞噬体加工过程中的机制作用。结果发现NDs处理导致NUPR1水平呈时间依赖性降低(图1e)。另外,ATG5/7缺失显著性地减轻了NDs引起的NUPR1耗竭。综上,证明了NDs通过损害细胞中NUPR1介导的自溶酶体渗透而起到自噬抑制剂的作用。

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图1

2.ATO处理的HepG2自噬抑制的机制分析

作者接下来研究自噬抑制在ATO处理的HepG2细胞凋亡增强中的分子机制。

CQ+ATO联合处理HepG2可以增强细胞毒性,相反,NB4(急性早幼粒细胞白血病细胞系,自噬水平低)与CQ和ATO联合应用处理并没显示出明显的细胞凋亡,这样表明自噬在ATO处理的APL细胞中不起作用(图2a、b)。

在证实了自噬抑制在HepG2中基于ATO的细胞毒性中起到重要作用后,作者进一步探索NDs如何影响ATO治疗的HepG2。与CQ相似,当NDs添加到ATO处理的HepG2细胞中后,WB结果显示LC-Ⅱ累计的增加以及p62降解的抑制(图2c)。共聚焦结果进一步证明NDs的共处理显著减少由ATO诱导的LC3小点的形成,同时增加了细胞中的LC3阳性点装结构的积累。(图2e)TEM成像结果显示共处理可以显著性减少ATO诱导的自噬体形成,并且诱导含有NDs的自溶体的积累。(图2e)另外,共处理好观察到细胞内存在许多液泡,并伴随着caspase-3活性的增加(图2e)。

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图2

3.NDs作为自噬抑制剂可以提高基于ATO的体内治疗疗效

为了评估NDs在基于ATO治疗中疗效,作者进行了一系列的体内外实验,从而评估NDs/ATO组合的治疗的安全性。NDs组相比于CQ组,血液中的各项指标较为稳定,且基本处于正常范围内(图3a)。在原位瘤模型中,NDs/ATO的血液循环曲线几乎每天保持恒定,并且每次给药后1/24h内从血液中清除(图3b)。此外,作者也检测它们的体内生物分布和清除率,在给药48小时后,NDs荧光信号显示NDs主要分布在肿瘤体,肝脏和肾脏中(图3c)。定量分析结果也显示NDs在脾和肺中累积,而ATO主要分布在肿瘤体,心脏,肝,脾,肺和肾(图3d)。绝大多数的NDs的累积在72小时后被清除了,而这个时间点又正好是下一次给药的时间点(图3d)。在证明NDs/ATO联合治疗疗法的突出生物相容性和肿瘤靶向性,作者进一步探讨NDs自噬抑制剂是否可以改善体内基于ATO的疗法。与NS组相比,首次给药后第91天,NDs/ATO组合将肿瘤重量降低至~33%,而单独使用NDs或者ATO(0.75mgkg-1)的治疗并没有显著影响肿瘤重量。对于1.5mgkg-1ATO组别,添加NDs可以将肿瘤重量从67%降低至9%,表明具有协同抗肿瘤作用(图4a,b)。另外,NDs/ATO组合可以降低肝脏肿瘤相关症状,如黄疸,肝腹水,以及肝硬化(图5a)。作者接下来探讨了治疗小鼠的存活率和健康状况。在NDs与高剂量ATO共同治疗的组中,小鼠存活150天以上。而与阴性对照组相比,单独使用不同剂量的ATO治疗只能提供有限的生存天数(图4e)。阴性对照组或ATO治疗组中的所有小鼠都死于疾病,实现长期生存的比例低于30%。此外,组织学分析,体重曲线和主要器官的系数表明,联合治疗方案没有明确的副作用(图4f,5b)。

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图3

4.NDs+ATO短期和长期治疗的研究

为了进一步比较NDs+ATO与ATO治疗的短期与长期内肿瘤重量,肝损伤相关血清生化指标,作者选择给药后35天和91天作为短期与长期的天数。结果表明NDs+ATO联合治疗组的肿瘤比重随时间降低,而ATO治疗组肿瘤的重量比随时间没有明显变化(图5c)。

更有趣的是,NDs-ATO联合治疗组中的所有生化参数在35天时或多或少增加,最终恢复到正常小鼠91天时观察到的范围。相比之下,ATO治疗组中的这些参数随时间显着增加(图5d)。此外,NDs+ATO比CQ+ATO具有更高的治疗效果。首次给药后第91天进行肿瘤重量比分析,发现NDs+ATO可将肿瘤重量减少约91%,而CQ+ATO仅为~58%(图4b)。CQ之所以疗效较低原因可能是肿瘤微环境pH值较低,阻碍CQ发挥抑制自噬作用。

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图4

5.NDs API增强肝癌ATO治疗的分子机制的探索

作者认为,NDs+ATO联合治疗的安全性和有效性来源于对器官的自噬特异性抑制。将荷瘤小鼠进行了LC2Ⅱ和ATG13进行免疫染色,结果发现,接受治疗的小鼠显示出明显的LC3Ⅱ和ATG13斑点,尤其是在肿瘤内部和周围血管的周围(图4g)。因此,作者确证了NDs+ATO联合治疗后肿瘤中自噬通量的调节。WB和TEM结果均证实NDs有抑制肝癌细胞组织中ATO诱导的自噬(图4c,6a)。TEM分析肿瘤结果也表明NDs在肿瘤部位的累积是由于增强的渗透性和保留效果(图6a)。

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图6

总结

砒霜,我国的一味传统的中药,具有良好的治疗白血病的功效,但是对于实体瘤的治疗却一直没有很好的效果。这篇文章通过对比APL与HepG2细胞之间的差异——自噬水平不同,从而提出科学家说——能否通过抑制实体瘤细胞自噬从而提高ATO对实体瘤发挥促凋亡作用?并且作者通过一系列的实验证明了这个科学假说,扩大了ATO临床上抗肿瘤的范围,具有较高的临床价值。但是,这其中的分子机理还可以做进一步探索。


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